犬の45％パーコール液と90％パーコール液を用いましてパーコール密度勾配遠心分離法を行います。これは不妊治療などされている方はよくご存知だと思いますが人間の人工授精時にも精子の洗浄と濃縮に用いられる方法で精子の成熟段階で細胞密度が変化する事を利用し精液中の不純物や変性細胞、先端異常精子、死滅精子を取り除く事ができます。成熟精子の細胞密度が最も高く未成熟精子は残存する細胞小滴のため、細胞密度が低く、また死滅した精子は細胞膜の透過性が変化し水分が細胞内に浸透するため、密度が低下します。
分かりやすくするために精液を染色しています。一番下に90％次に45％パーコール。一番上に精液を積層すると当然比重の違いからこのように分かれます。パーコール液は市販の90％濃度のものと45％濃度のものを使用しています。これを遠心分離します。
800rpmで15分間遠心分離すると↑のようになり矢印で示す部分に精子のペレットが見えます。見事に成熟した精子以外は上部に取り残されている事が分かります。この最下部の精子ペレット以外をすべて取り除き希釈液で任意の濃度に調節すると精液から精子のみを分離する事ができます。こちらで凍結精子を作成する際に使用している希釈液等に活力剤や精子保護剤を添加していることで溶解後も高い授精能力をもった精液を作成する事が可能です。細菌なども分離される為、凍結精液の事前処理として長期保存を行う場合には必須となります。
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